王静竹吴侔天 张亦农 刘欣 杨志勇
国家体育总局运动医学研究所(北京100029)
自20世纪50年代以来,合成类固醇的使用已是滥用兴奋剂药物之首。外源性类固醇激素的检测方法已经较为成熟,以检测代谢产物为主。现在,有些运动员为了逃避兴奋剂的检查而越来越多地使用内源性类固醇激素制剂。内源性类固醇激素在人体自身中也会分泌,因此不能再使用定性的方法进行检测。内源性类固醇是体内能自身合成的激素,包括睾酮、双氢睾酮、表睾酮、脱氢表雄酮、雄烯二酮等。一般而言,人体中内源性类固醇激素的浓度个体差异较大,而一些内源性类固醇激素的浓度比值较为稳定。服用内源性类固醇激素可使人尿中该种类固醇及/或其代谢产物浓度发生变化,当尿中这些类固醇浓度及/或其比值超出正常范围时,可怀疑尿样是否为兴奋剂阳性。因此,对正常运动员尿样中内源性类固醇激素的浓度进行统计,为确定正常范围建立依据,是一件较有意义的工作。本研究采用气相色谱/质谱(gc/ms)方法测定类固醇激素的含量,对2001年我国1217名运动员尿中8种类固醇激素的含量进行了测定及统计分析。
1 实验材料
1.1 仪器与设备
仪器设备:气相色谱/质谱联用仪(gc/ms):hp6890气相色谱仪/hp5973质量选择检测器(安捷伦公司生产);旋转蒸发仪:herdolph2000(瑞士);吹氮头(北京市朝阳区洼里医疗器械厂)。仪器操作条件:气相色谱/质谱联用仪分离条件:色谱柱:hp-1毛细管色谱柱,[email protected]@0.11lm。分流比:1b10。进样口温度:280e;接口温度:300e。升温程序:180e-3.3e/min->231e-30e/min->310e(2min)。选择离子方式检测。
1.2 试剂、标准品及样品
试剂:b-葡萄糖醛酸甙酶(b-glucuronidasefrome.coliix-a型),sigma;固定相ouuya-rp18,80-
100微米,瑞士分装;以下均为分析纯试剂:磷酸二氢钾(kh2po3):北京市红星化工厂磷酸氢二钠(na2hpo3):北京市红星化工厂碳酸钠(na2co3):北京化工厂碳酸氢钠(nahco3):北京化工厂甲醇(ch4o):北京化工厂叔丁基甲醚(methylt-butylether):美国tediacompanyinc.标准品:雄酮(androsterone)、本胆烷醇酮(etio2cholanolone)、双氢睾酮(dihydrotestosterone)、脱氢表雄酮(dehydroepiandrosterone)、睾酮(testosterone)、表睾(epitestosterone)、5a-雄烷-3a,17b-二醇(5b-androstane-3a,17b-diol)、5b-雄烷-3a,17b-二醇(5b-androstane-3a,17b-diol)、等均来自sigma公司或其他国家兴奋剂检测实验室。(以上各化合物分别缩写为an.、etio.、dht、dhea、t、et、5a-diol、5b-diol)样品:待测尿样来自运动员正常尿样
2 实验步骤
2.1 标准品溶液的制备
配置混合标准品甲醇溶液,浓度为雄酮500lg/ml、本胆烷醇酮500lg/ml、双氢睾酮125lg/ml、脱氢表雄酮100lg/ml、睾酮50lg/ml、表睾25lg/ml、5a-雄烷-3a,17b-二醇50lg/ml、5b-雄烷-3a,17b-二醇50lg/ml。标准品检测溶液的配置:取上述溶液10ll及内标溶液(甲睾50lg/ml)50ll,于衍生化小瓶中,在加热的情况下,用氮气吹干,加入50ll混合衍生化试剂mstfa/tmsi/dithioer(1000b3b1),70e反应30min。
2.2 样品预处理
取尿样5ml,离心后取上清尿样加至以c-18
为固定相的小柱上,同时加入内标溶液(甲睾50lg/ml)50ll,待尿样流过柱后,用5ml蒸馏水洗涤小柱,用2ml甲醇洗脱。洗脱液经旋转蒸发仪蒸干后,加入1ml012molph=710的磷酸缓冲液和100llb-葡萄糖醛酸甙酶(5000iu)混匀,在55e恒温水浴中培养3h(或37e,培养16h),取出后加固体缓冲剂约100mg和5ml叔丁基甲醚,振荡萃取,离心后,取出上层有机溶液,在加热的情况下,用氮气吹干,加入50ll混合衍生化试剂mstfa/tmsi/dithioer(1000b3b1)溶解残渣,转入衍生化小瓶中,70e反应30min。
2.3 样品测定
依1.1中仪器操作条件,对经2.1及2.2处理后的标准品溶液和样品进行gc/ms分析,由得到的内源性类固醇激素及内标的峰面积值,按下列公式计算其含量：cx(ng/ml)[email protected]@asis/([email protected])其中cx为尿样中某类固醇激素浓度;cs为标准溶液中浓度;ax为尿样中某类固醇激素峰面积;asis为标准品检测溶液中内标物峰面积;axis为样品溶液中内标物峰面积;as为标准品峰面积。
2.4 数据统计
对8种内源性类固醇激素的浓度进行正态分布统计。
3 结果与讨论
3.1我国运动员尿中内源性类固醇激素总体水平本研究统计了我国1217名男女运动员的尿样,其中8种内源性类固醇激素含量见表1
表1 我国运动员尿中内源性类固醇激素水平
table1 urinarysteroidprofileforchineseathletes类固醇激素尿中浓度平均值(ng/ml)n=1217
an866.7
etio651.6
dht2.2
dhea22.0
et11.2
t8.2
5a-diol15.4
5b-diol21.7分析结果表明,在所统计的8种内源性类固醇激素中,雄酮(an)和本胆烷醇酮(etio)在尿中浓度最高,其次是脱氢表雄酮(dhea),5a-雄烷-3a,17b-二醇(5a-diol)和5b-雄烷-3a,17b-二醇(5b-diol),表睾(et),睾酮(t),双氢睾酮(dht)。由代谢途径可知,雄酮(an)和本胆烷醇酮(e2tio)为多步多途径代谢的产物,因此,它们在尿中的浓度较高。
3.2 我国运动员内源性类固醇激素浓度比
由代谢途径推知,如果没有服用类固醇制剂,体内正常分泌时,一些内源性类固醇激素浓度比,如t/et!an/etio!5a-diol/5b-diol等,应该较为恒定。我国运动员尿中内源性类固醇激素浓度比见表2。
表2 我国运动员尿中内源性类固醇激素浓度比
table2 concentrationratiosofurinarysteroidsforchineseathletes
内源性类固醇浓度比比值的平均值,n=1217
an/etio1.36
t/et0.64
5a-diol/5b-diol0.86
3.3 我国男运动员尿中内源性类固醇激素水平本研究统计了我国756名男运动员的尿样,其中8种内源性类固醇激素含量及国外文献数据见表3。
表3 男运动员尿中内源性类固醇激素水平
table3 urinarysteroidprofileformaleathletes
类固醇激素
尿中浓度平均值
(ng/ml)
我国 n=756
尿中浓度平均值
(ng/ml)
国外
国外数据
/国内数据
an988.62975 n=51013.0
etio636.92279 n=51013.6
dht2.0
dhea23.4
et13.435.7 n=50952.7
t10.844.6 n=51004.1
5a-diol17.860.4 n=50883.4
5b-diol23.6166.5 n=50887.0
由表3可知,我国男运动员尿中内源性类固醇
浓度一般低于国外统计数据"
3.4 我国男运动员内源性类固醇激素浓度比
我国男运动员尿中内源性类固醇激素浓度比及
国外文献数据[3]见表4"
表4 男运动员尿中内源性类固醇激素浓度比
table4 concentrationratiosofurinarysteroidsformaleathletes
内源性类固醇
浓度比
比值的平均值
我国n=756
比值的平均值
国外
国外数据
/国内数据
an/etio1.491.43 n=52831.0
t/et0.731.65 n=52772.3
5a-diol/5b-diol0.970.52 n=52830.54
由表4可知,我国男运动员尿中t/et比值低于国外统计数据,an/etio比值与国外统计数据接近,5a-diol/5b-diol比值高于国外统计数据。
3.5 我国女运动员尿中内源性类固醇激素水平本研究统计了我国418名女运动员的尿样,其
中8种内源性类固醇激素含量及国外文献数据。见表5。
表5 女运动员尿中内源性类固醇激素水平
table5 urinarysteroidprofileforfemaleathletes
类固醇激素
尿中浓度平均值
(ng/ml)
我国 n=418
尿中浓度平均值
(ng/ml)
国外
国外数据
/国内数据
an650.62286 n=16963.5
etio704.52326 n=16963.3
dht2.3
dhea19.7
et5.110 n=16932.0
t2.712.6 n=16934.7
5a-diol7.725.1 n=16943.2
5b-diol16.992.5 n=16945.5
由表5可知,我国女运动员尿中内源性类固醇
浓度一般低于国外统计数据"
3.6 我国女运动员内源性类固醇激素浓度比
我国女运动员尿中内源性类固醇激素浓度比及
国外文献数据[3]见表6"表6 女运动员尿中内源性类固醇激素浓度比
table6 concentrationratiosofurinarysteroids
forfemaleathletes
内源性类固醇
浓度比
比值的平均值
我国 n=418
比值的平均值
国外
国外数据
/国内数据
an/etio1.111.04 n=17420.9
t/et0.461.83 n=17364.0
5a-diol/5b-diol0.670.41 n=17420.6
由表6可知,我国女运动员尿中t/et比值远低
于国外统计数据,an/etio比值与国外统计数据接
近,5a-diol/5b-diol比值稍高于国外统计数据"
4 总结
(1)我国男性运动员尿中大部分类固醇激素水平高于女性运动员。(2)我国男、女运动员尿中类固醇激素水平均普遍低于国外统计数据,且我国男运动员尿中类固醇激素水平与国外统计的男性数据相差程度近似于我国女性与国外数据的相差程度。(3)我国运动员testosterone与5b-diol浓度明显低于国外统计数据,分别达4倍和7倍。(4)一些类固醇激素比值如an/etio!t/et、5a-diol/5b-diol变化范围较小,且在男女之间差别不大。我国运动员尿中t/et比值低于国外统计数据,且女性运动员更低。(5)类固醇激素含量与人种、遗传、饮食习惯、身体状态等多种因素有关,激素含量与运动成绩的关系及如何利用激素含量提供的信息提高运动成绩有待进一步研究。
